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http://ipicyt.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1010/1803| Optimización de la producción de vasostatina 30 y su proteína de fusión VS_VI en biorreactor | |
| GABRIELA VAZQUEZ RODRIGUEZ | |
| Antonio de León Rodríguez | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución-NoComercial-SinDerivadas | |
| Diseño experimental RSM Proteína recombinante Células endoteliales Proliferación celular | |
| "La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes y juega un papel clave en el desarrollo y progresión de enfermedades crónico-dependientes como la retinopatía diabética, artritis reumatoide, cáncer, entre otras. Actualmente, se ha generado gran interés por el diseño y estudio de nuevos péptidos antiangiogénicos que contribuyan a la inhibición del crecimiento y metástasis tumoral con los menores efectos adversos. Las vasoinhibinas (Vi) y la vasostatina (Vs) son péptidos aminoterminales inhibidores de la angiogénesis que son generados por proteólisis de la prolactina (PRL) y la calreticulina (CALR), respectivamente, y que además son prometedores agentes terapéuticos en el tratamiento contra el cáncer. La vasoinhibina de 14.1 kDa (Vi-II-14.1), la vasostatina de 30 residuos de aminoácidos que comprende de 135-164 a.a. de la CALR (Vs30) y su respectiva proteína de fusión denominada VS_VI, han demostrado tener una significativa actividad antiproliferativa de células endoteliales estimuladas con Bradicidina. Debido a que se conoce muy poco del mecanismo de acción de la Vs30 y por consiguiente de su proteína de fusión VS_VI, el objetivo del presente trabajo fue optimizar la producción de las proteínas Vs30 y VS_VI en biorreactor mediante el uso de diseños experimentales y la metodología de superficie de respuesta (RSM), para así contar con una cantidad suficiente de éstas proteínas y caracterizarlas posteriormente. Los genes que codifican las proteínas Vs30 y VS_VI fueron clonados en el vector pGVR (pET22b lacI-) bajo el promotor de T7. Las construcciones fueron transformadas en E. coli BL21-SI y BL21-SI/pLysSRARE, respectivamente. Se realizaron dos diseños experimentales, el diseño Box-Behnken para la optimización de Vs30 y el diseño compuesto central para optimizar la proteína de fusión VS_VI. En la producción de las proteínas recombinantes se evaluó el efecto de los factores de temperatura de inducción (Ti), tensión de oxígeno disuelto (TOD) y pH a tres niveles cada uno. Mediante modelos de segundo orden se encontró que las mejores condiciones para la producción total de Vs30 recombinante fueron: pH 7, TOD 20% y 28.8 ºC de Ti; y para VS_VI recombinante total fueron: pH 6.97 y 27.82 ºC Ti; mientras que para Vs30 soluble fueron: pH 7, TOD 20% y 27.1ºC de Ti; y para VS_VI soluble fueron: pH 7.0 y 28.5ºC de Ti." "Angiogenesis is the formation of new blood vessels from preexisting ones and plays a key role in development and progression of angiogenic-dependent diseases such as diabetic retinopathy, arthritis rheumatoid, and cancer, among others. The design and study of new antiangiogenic peptides that contribute to inhibition of tumor growth and metastasis with the minimum secondary effects, has generated a considerable interest. Vasoinhibins (Vi) and vasostatin (Vs) are Nterminal peptides released by proteolysis of human prolactin (hPRL) and calreticulin (CALR), respectively, that inhibit angiogenesis besides to be promising therapeutic agents in cancer treatment. The vasoinhibin of 14.1 kDa (Vi-II-14.1), the vasostatin of 30 amino acids residues from 135-164 a.a. of CALR (Vs30) and their fusion protein VS_VI, have shown a significant antiproliferative activity on endothelial cells in presence of Bradykinin. Most of the mechanism of action Vs30 remains unknown, and also of its fusion protein VS_VI, therefore, the aim of this study was to optimize the production of the antiangiogenic proteins Vs30 and VS_VI in bioreactor, by using experimental designs and the response surface methodology (RSM) to have enough quantity of these proteins to further characterization. The Vs30 and VS_VI genes were cloned into pGVR (pET22b lacI-) vector under T7 promoter. The constructions were transformed into E. coli BL21-SI and BL21- SI/pLysSRARE, respectively. Two experimental designs were used, the Box- Benhken design to optimize Vs30 and the central composite design to optimize the fusion protein VS_VI. In the recombinant protein production, the effect of post induction temperature (Ti), dissolved oxygen tension (DOT), and pH factors were evaluated at three levels each. By second order models we found that the best culture conditions for total rVs30 were: pH 7, DOT 20% and 28.8ºC of Ti; and for total rVS_VI were: pH 6.97 and 27.82ºC of Ti; meanwhile, for rVs30 soluble the best conditions were: pH 7, DOT 20% and 27.1ºC of Ti; and for rVS_VI soluble were: pH 7.0 and 28.5ºC of Ti. The central composite (CC) design is the best experimental design to optimize recombinant protein production. With the CC design was posible to obtain the optimum conditions for rVS_VI production, aim that was not posible to reach by using Box-Behnken design." | |
| 2013 | |
| Tesis de doctorado | |
| BIOLOGÍA MOLECULAR | |
| Aparece en las colecciones: | Publicaciones Científicas Biología Molecular |
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